超速离心:是囊泡分离的“金标准”,外泌体得率较高;但对实验仪器要求特殊,耗时较长,无法实现高通量。
提取试剂盒:基于外泌体表达的特异性表面抗原,利用相应的抗体通过免疫亲和分离,无须超速离心,耗时较短,可实现高通量;但相比超速离心,外泌体得率较低。
目前半岛分离外泌体采用的是 Qiagen ExoEasy kit。
这种情况其实还是没有成瘤。成瘤过程一般是细胞注射后有圆形小包,然后很快消失,再隆起(一般是组织液),再变小变红(血管生成),最后肿瘤快速生长。因此没有成瘤只是第二阶段,建议调整一下细胞注射量、更换实验鼠或添加一些促进细胞生长的因子试试。
有必要,至少需要两次生物学重复,3次以上的生物学重复更好。2011年7月Hansen发表的文章表明生物学差异是基因自身表达的特性,与检测技术的选择以及数据处理的方式无关。如果不设生物学重复,高影响因子的杂志可能会因此而拒稿。
四个要点需要注意:一是要快,尽快洗净或处理,处理后快速冷冻。细胞可以直接用Trizol裂解后冷冻,组织洗净后,分成小块直接冷冻;二是低温,先浸入液氮,数小时后再放入-70或-80度超低温冰箱缓冻为佳。超低温冰箱可以保存数月至一年以上,-20度不宜久存;三是避免温度波动,一台经常开关门,温度上下波动的-80度冰箱,可能冷冻效果还不如一天稳定在-40度的冰箱;四是推荐进口冻存管,标签冷冻后容易破碎,不妨自己用记号笔进行标记。
组内差异大主要表现是组内老鼠有的长不出肿瘤组织,有的缺长得很大。原因很多,其一可能是接种悬液没有摇匀,这种可能性较小;其二是可能存在一定的个体差异,鼠龄是一个很大的影响因素,建议控制好实验条件,动物周龄控制在5-6周左右,体重均一,健康状态一致。
优先建议做3次实验重复,符合一般的文章对实验数据的要求,不建议使用两重复或只做一次,可能引起审稿人和编辑的质疑。
技术重复一般和上机重复非常类似,即上质谱的重复,即测试仪器的稳定性,判断系统误差等问题。而应用型的文章中,上机重复或技术重复一般没有硬性规定,可以不做,如果做了当然最好,Editor就不会再此处找你的问题。
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